如何使用全功能超微量紫外可见分光光度计

2022-06-28 10:55 普通小龙包

什么是超微量紫外可见分光光度计
 

超微量分光光度计是精密的光谱仪器,出厂前经过精细的调校,如果能对仪器进行恰当的维护和保养,不仅能保证仪器的重复性和稳定性,也可以延长仪器使用寿命。

超微量分光光度计常用来检测A230、A260、A280,并以此分析核酸以及蛋白的浓度和纯度,在物理学、化学、生物学、医学、材料学、环境科学等科学研究领域都有非常广阔的应用。

相较传统分光光度计,超微量分光光度计的主要特点是上样量低,仅需1滴样品(核酸样品仅需0.5微升,蛋白样品需1微升),即可完成检测。

国产自研品牌,普睿博仪器,精心打造的超微量紫外可见分光光光度计,Pono-650,采用高亮度氙灯和紫外增强型cmos以确保核酸样品以及蛋白样品的准确稳定,支持200~800 nm全波长扫描,支持自定义检测波长。同时集成比色皿OD600检测功能,可以指示细菌、酵母或细胞的生长密度,也集成了荧光检测功能,完美适配对极低浓度核酸样品的检测需求。

各种光谱仪(分光光度计)具体区别见下图。
 


超微量分光光度计的工作原理
与传统分光度计一样,超微量分光光度计遵从郎伯比尔定律。
                                                                                                   
在检测核酸蛋白时,超微量分光光度计可以测试获得样品浓度,无需使用标准品,无需建立标准曲线。其他形式的检测则与传统分光光度计一致,需要使用标准品建立标准曲线进行测试。

相关参数详解见下表。

 
 

 


使用超微量分光光度计进行核酸检测

超微量分光光度计检测A260,并以此对核酸进行定量。通常,核酸包括dsDNA、ssDNA和RNA,他们的消光系数各不相同。进行检测时,先用溶剂进行空白检测(通常是TE缓冲液或水),再滴加0.5~2微升样品在上样台上,等待数秒即可获得检测结果。

相关参数详解见下表。

 



 
 
 


使用超微量分光光度计进行蛋白检测

超微量分光光度计检测A280,并以此对蛋白进行定量。蛋白质成分复杂,因氨基酸序列和蛋白质空间结构不同,他们的消光系数各不相同。进行检测时,先用溶剂进行空白检测(通常是PBS缓冲液或水),再滴加1~2微升样品在上样台上,等待数秒即可获得检测结果。

相关参数详解见下表。

                                                           



 
BCA法和考马斯亮蓝法检测蛋白质

超微量分光光度计可以通过BCA法和Bradford法对蛋白进行定量。需要搭配染料试剂和蛋白标准品使用,需要建立标准曲线。通常,更推荐使用酶标仪进行分析。

相关参数详解见下表。

                                                          







                                       荧光法检测核酸和蛋白
通过荧光染料特异性结合DNA分子,并激发出荧光,以检测荧光强度的方式来间接定量DNA,这样获得的检测结果更加准确,且灵敏度可达0.5pg/μl(dsDNA),检测下限极低,并可以有效避免RNA、蛋白、酚类物质、盐酸胍等物质的干扰。这种检测方法需要搭配额外的荧光染料试剂来使用。

常见核酸检测方法见下表。

 

 

如何评价超微量分光光度计的性能
首先是重复性检测。例如我们使用DNA样品,测A260,对一个样品进行上样/检测/清洗的操作流程,重复操作3-5次,如果重复性偏差小于3%,说明稳定性良好,结果可靠。

再者是稳定性检测。例如我们使用DNA样品,将样品稀释成不同浓度,检测这些样品得到的数据做曲线,和由稀释操作得到的理论标准模型曲线是否无限接近。表现为趋势性拟合的曲线R2是否接近1。可以认为在R2超过0.995的情况下,吸光度数据是真实随着浓度变化的,数据是可靠的。

最后是准确性检测,例如我们使用IgG标准品,当实际检测结果与标定数值有较大差异时,可判定仪器准确性有故障,可联系厂商进行校准,建议多台分光光度计进行比对,以确保标准品可靠。准确性故障多为仪器硬件老化、光源亮度变化等原因造成,不影响仪器的重复性和稳定性,通过校准即可复原,建议定期维护校准仪器。


 
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